光學(xué)顯微鏡所面臨的主要問題之一是克服某些光學(xué)分辨率的限制并提高系統(tǒng)的NA值。簡言之，物鏡的NA是指從標(biāo)本中收集光的能力，而分辨率是指物鏡分辨標(biāo)本中細(xì)節(jié)的能力。

分辨率和NA將在其他文章中詳細(xì)說明，我們現(xiàn)在將介紹顯微鏡專家可用的浸沒技術(shù)，這種技術(shù)可在高倍放大率下對標(biāo)本進(jìn)行成像，同時克服分辨率的一些限制。

在物鏡前透鏡和標(biāo)本蓋玻片之間的空隙中填充浸沒液體可提高物鏡的分辨率。當(dāng)光從一種介質(zhì)傳遞到另一種介質(zhì)（例如，通過玻璃到空氣）時會發(fā)生折射 - 換句話說，光會彎曲并散射。任何折射到空氣中的光線、被蓋玻片反射的光線或被物鏡前透鏡的金屬外殼實際阻擋的光線都不會對成像產(chǎn)生貢獻(xiàn)。浸沒液體的目的在于減少光在標(biāo)本上形成的折射和反射，并提升物鏡捕捉這些偏離光的能力（見圖1）。

圖1

理想情形是創(chuàng)建所謂的“均質(zhì)浸沒系統(tǒng)"。使用該系統(tǒng)可以獲得最大的分辨率和NA。均質(zhì)浸沒系統(tǒng)的目的是匹配（盡可能接近）物鏡前透鏡、浸沒介質(zhì)、蓋玻片/載玻片、封片劑和（原則上）聚光鏡透鏡的折射率和NA（見圖2和表1）。

通常不需要在聚光鏡的透鏡上使用浸沒液體。如果顯微鏡的設(shè)置和校準(zhǔn)正確，且在整個樣本上獲得最佳對比度和照明度（見“關(guān)于科勒照明"的文章），則聚光鏡將處于最適宜的位置和設(shè)置，從而有助于顯微鏡系統(tǒng)的整體NA。

圖3

大多數(shù)現(xiàn)代化浸油都是人工合成并經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理，確保不會損壞透鏡或隨著老化而變色。要記住的一點是，浸油有一個最佳的工作溫度。大多數(shù)商用合成油的設(shè)計工作溫度為23℃，僅1℃的變化將導(dǎo)致折射率變化0.0004。其他浸油可在不同溫度下獲得最佳性能，但對于大多數(shù)用途，顯微鏡設(shè)備應(yīng)在23℃下保持穩(wěn)定（這對于共聚焦顯微鏡等儀器的維護(hù)也很重要）。

使用油浸式物鏡（見圖4）開展熒光顯微鏡觀察時，建議使用特殊的低自體熒光油。很多通用浸油在特定情況下將會發(fā)出熒光。大多數(shù)用于熒光顯微鏡的浸油都通過名稱/代碼之前或之后加上字母“F"來識別。

水浸式物鏡通常與正置顯微鏡配置一起使用，用于直接浸入水或水基介質(zhì)/緩沖液中。水澆蘸物鏡則可提供很長的工作距離。這種物鏡在生產(chǎn)時還配有十分曲折的彎角轉(zhuǎn)盤，使用惰性材料如陶瓷等制作而成。水浸物鏡的使用方式與油浸物鏡類似，但要用水代替油。

使用水浸式物鏡的優(yōu)點之一是簡單地將水作為浸沒介質(zhì)。很明顯，這種介質(zhì)很容易清洗。此外，您不需要根據(jù)正在進(jìn)行的成像使用特定的浸沒油，也不需要使用顯微鏡和物鏡制造商zhiding的浸沒介質(zhì)。但使用水浸式物鏡時有一些缺點。與水性物鏡相比，油浸物鏡具有更高的分辨率。此外，由于水的粘度（與油相比），使用水浸式物鏡容易受到振動和小空氣運動的影響。這種問題可以通過確保顯微鏡放置在防振臺上來克服。或者，更簡單的解決方案是在切片上放置一個特殊的環(huán)來形成一個小水池。水浸式物鏡的最后一個缺點是成本。一些水浸式物鏡的成本相當(dāng)于一套完整的研究級顯微鏡。

徠卡提供的水浸顯微鏡自動加水裝置克服了長時間活細(xì)胞成像或篩查實驗中出現(xiàn)水蒸發(fā)的潛在問題（見圖6）。

活細(xì)胞通常置于細(xì)胞間室并且會被細(xì)胞培養(yǎng)基（或緩沖液）所覆蓋。間室（和培養(yǎng)基）有助于確保細(xì)胞或組織在成像的同時處于穩(wěn)定的環(huán)境內(nèi)。因此，到小室蓋片的最佳焦距將變得比較大，這使得工作距離較短的油浸式物鏡不適合通過蓋玻片/間室、培養(yǎng)基/緩沖液對細(xì)胞/組織成像。

此外，使用油浸式物鏡來觀察水性培養(yǎng)基內(nèi)的細(xì)胞時還會增加額外的折射問題，因為油和水的折射率不同。

觀察間室內(nèi)的活細(xì)胞時，光路將遇到不同的折射率。間室/蓋玻片的材料和覆蓋細(xì)胞或組織的水性培養(yǎng)基之間存在不同的折射率。從標(biāo)本圖像中傳出的光將在每個階段發(fā)生折射而導(dǎo)致球面像差。

DMi8 S 模塊 INFINITY TIRF 全內(nèi)反射熒光系統(tǒng)

DM4B & DM6B生物顯微鏡